四、二代测序检测报告解读
目前，二代测序检测报告建议以ACMG指南为标准，检测结果中需列出具体的变异位点信息，包括基因名称、所参考的人类基因组版本号、基因或转录本参考序列（NM_编号）和版本号、核苷酸变异、氨基酸变异、外显子/内含子序号、等位基因杂合性、染色体编号和坐标、变异的亲源等，提供对该变异致病性的判断及支持该判断的依据和文献。其中变异位点的命名可按照人类基因组变异协会（Human Genome Variation Society，HGVS）的规定；转录本的选择建议采用基因座参考基因组序列数据库（Locus Reference Genomic，https：//www.lrg-sequence.org/）界定的转录本或多个国际数据库公认的主要转录本；对于变异位点致病性的评级建议根据ACMG的指南分为致病、疑似致病、临床意义未明、疑似良性、良性5个等级。指南提供了28个标准，每个标准对应了一个代码（如PVS1、BA1）代表不同类型的证据，每个标准的代码由致病性和强度两部分组成，致病性又分为良性（B）及致病（P），证据强度由强到弱依次分为单独证据（A）、非常强（VS）、强（S）、中等（M）、支持（P），除此之外，指南提供了相应的组合规则对突变位点进行判定。
当前临床进行产前WES或WGS的主要挑战之一，是这些检测的潜在检测周期长。尽管通过孕早期扫描测量NT和唐氏综合征筛查，在妊娠早期发现严重或致死的先天性疾病的频率越来越高，但大多数胎儿结构异常需要在孕18~22周的孕中期超声扫描中才能被发现。这意味着必须快速完成基因检测，以便在怀孕期间为决策提供信息，这就要求DNA测序和数据注释分析的环节必须快速准确。使用针对特定胎儿异常的基因panel的分析流程也可以缩短分析周期，要实现这一点，必须具有特定和明确的表型，这在产前尤其具有挑战性。因此，实际上WES可能是目前实现快速诊断的最有效手段。随着对变异的理解不断加深，WES可能有助于告知未来目标基因panel的信息，对我们进行WES注释与分析的水平提出了更高的要求。
尽管产前超声和磁共振成像取得了进展，但胎儿表型采集的困难使得产前基因型-表型相关性比产后更具挑战性。由于实施超声检查的从业人员的技能水平差异很大，可能导致胎儿结构异常的过度诊断或诊断不足。出于这些原因，在解释之前未报告的变异时必须非常谨慎，以避免过度解释潜在的正常变异。除此之外，还有一些微妙的特征改变，许多单基因疾病不能用胎儿超声确定。胎儿疾病的表型异质性、不完全外显率和仅在孕晚期出现的超声异常会使解释遗传变异更加复杂。有些表型是无法通过产前影像确定的，例如一些发育迟缓和智力残疾相关的疾病。因此，当没办法获取胎儿细节的表型时，很难确定最合适的候选基因或应用正确的基因panel。当妊娠终止后，由相关专家进行的产后检查或胎儿尸检，也可以帮助细化相关表型和确定目标基因而进行更具体的研究。其最终产前WES的报告均应当经过检验人员、生信人员、医学遗传学专业技术人员以及临床医学专业和母胎医学专业医师的审核。对于复杂疑难病例，应当建立长效的会诊机制，由多个相关专业技术人员共同讨论。
当基层医疗机构产科门诊等接诊相关具有产前诊断指征的家庭后，建议严格按照相关法律法规和诊断流程进行规范化的处置。在诊断过程中，如遇诊断困难或因诊疗条件受限无法继续诊治的患者，建议及时向上级医院产前诊断中心转诊；经区域产前诊断中心明确诊断后的患者，行遗传咨询并制定相应方案后应向下级医院转诊，可转至相应基层医疗机构继续随访和后续管理。通过规范化进行双向转诊，简化转诊手续、缩短转诊时间、提高转诊效率及降低因转诊程序烦琐给患者带来的风险。
五、单基因病与PGT-M
罕见遗传病作为出生缺陷的重要组成部分，80%~85%具有遗传基础，且绝大多数由基因突变导致。根据世界卫生组织（WHO）的定义，罕见病为患病人数占总人口的0.65‰~1‰的疾病或病变，目前全球已知6 000~8 000种，50%在出生或儿童期即发病，仅有少于6%的罕见病具备有效治疗方法，患者生存及生活质量严重受损。因人口基数庞大，中国目前估计约有2 000万名罕见病患者，所以罕见病在我国并不罕见。若要从根本上减少并防止罕见病的发生，必须进一步完善孕前遗传学咨询、产前检查与疾病筛查体系，从源头进行阻断。辅助生殖技术与遗传学诊断技术的飞速发展，为我们带来了植入前胚胎遗传学检测技术（Preimplantation Genetic Testing，PGT），在阻断罕见病等出生缺陷发生方面发挥着至关重要的作用。
PGT是一种检测胚胎遗传物质组成的方法，可用于单基因疾病（PGT-M）、染色体结构重排（PGT-SR）和非整倍体（PGT-A）的检测。PGT可以在胚胎移植到母体之前对活检样本的单个或多个细胞进行活检，检测胚胎的遗传状态，进而选择性移植胚胎。针对PGT-M，待检测的夫妻一方携带显性致病基因，或者夫妻双方都携带隐性基因，或者有特定遗传疾病家族史的夫妇，均为单基因疾病高风险妊娠夫妇。这些夫妇通常是有生育力的，在自然受孕的情况下，通过脐血穿刺、羊膜腔穿刺或绒毛穿刺的方法获取胎儿的遗传情况，提高遗传异常的胎儿终止妊娠的可能性。当已知遗传性疾病的可遗传性时，可通过辅助生殖治疗结合单基因植入前遗传检测（PGT-M），提供一种有效的替代传统方法的检测。在这个过程中，体外受精产生的胚胎在移植到子宫前需接受活检和基因检测。
PGT-M技术发展的主要限制因素是从单个二倍体细胞中的微量DNA中检测到变异。其DNA扩增失败（AF）、DNA污染、扩增偏移和等位基因脱扣（ADO）等风险增加与其微量DNA的局限性有关，这些风险都可能会影响检测结果的可靠性。随着分子遗传学技术发展，单细胞扩增步骤实现了优化，通过结合致病位点和SNP位点连锁分析等方法，相应降低了漏检的风险。然而，PGT-M需要为不同的夫妇开发个性化的实验方案，通常需要几周的准备时间。随着检测技术的不断变革，检测范围更广、准确性和灵敏度更高，但微量样本的获取与检测之中的问题仍是PGT-M应用过程中的主要难点，如何安全地获取有效胚胎遗传性样本和如何准确地完成遗传性样本的筛查及诊断是PGT安全性和有效性的保障。
PGT技术自诞生以来，在染色体病、胚胎非整倍体检测、单基因遗传病等方面得到了广泛应用，在阻断异常染色体和致病基因的子代传递、降低流产和出生缺陷发生风险等方面显示出了广阔的应用前景。其中主要利用PGT-M技术针对单基因病遗传病导致的出生缺陷进行一级防控。PGT技术虽然不断完善，但胚胎存在嵌合体及检测技术局限性等问题仍不容忽视，因此行PGT辅助生殖技术的患者在妊娠中期仍然需要进行有创产前诊断以明确胎儿的遗传信息。
六、单基因病前沿技术进展
在临床和研究过程中，常规使用基因检测普遍提高了单基因病的诊断率，并揭示了许多罕见遗传病的遗传基础，但仍然大约有一半疑似单基因病的受检者未被诊断。通过DNA测序进行检测但未诊断的个体主要分为两大类：①检出DNA序列上的变异或结构变异不完全符合其个体的表型（意义未明变异）；②利用外显子组测序技术在内的常规临床评估，未能发现任何候选变异或仅确定符合表型的隐性疾病的一个等位基因变异的患者。因此，急需新的工具和技术来提供全面和准确的遗传变异调查，提高诊断率。
常规临床检测方法，如染色体微阵列（CMA）和外显子组测序，并不能提供人类遗传变异的完整图谱。其中重复扩增、插入、缺失、重排等结构变异（SV）可能是许多未被检测到的致病性变异的原因，但使用现有的短读长高通量测序技术很难识别这些变异。长读长测序（LRS）技术可以对天然DNA分子进行测序，可产生平均1 000~100万碱基对长度的reads，同时还提供DNA甲基化信息，使检测SV的性能得到极大的改善。然而，为全基因组分析测序生成足够的LRS数据的价格仍然昂贵，令人望而却步，这使得比较短读长高通量测序和长读长测序的研究具有极大挑战，并减缓了在临**应用的步伐。
专家提示
① 对于曾生育明确单基因遗传病患儿的家庭，需明确其患儿的遗传病因后，再行产前诊断。
② 遗传咨询门诊应了解各类遗传检测原理，因WES检测技术的局限性，对于基因组同源区域的较小缺失/重复，或高GC区域等并不能很好地检出，对于地中海贫血、常染色体隐性遗传病（**A）、X染色体连锁隐性遗传病（DMD），等疾病应选择相应合适的技术来进行检测。
③ 产前检测的一个重要目的是进行基因诊断，以便遗传咨询时准确评估其复发风险和未来怀孕的检测选择。然而即使WES在高度怀疑的候选基因之中检出变异，其检测结果也可能无法明确其变异的致病性。更重要的是需向患者强调，阴性WES结果并不能排除受检者存在遗传病的可能。
④ 由于WES基因检测和分析的复杂性，其高度依赖于表型信息以及对应的遗传变异类型，产前检测的变异解读受到观察产前胎儿表型的限制。因此对于胎儿产前WES的检测，临**不建议应用于妊娠早期或影像学结构正常的胎儿。
⑤ 当检测报告发现临床意义未明的变异时，建议到专业的遗传咨询门诊进行系统的遗传咨询，进行家系分析或基因型—表型重分析，以便于辅助进行变异的致病性判定。
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