我国是人口大国，也是出生缺陷发生率较高的国家。据估计，我国出生缺陷发生率在5.6%左右，每年新增出生缺陷数约90万例，其中单基因病约占0.38%。

单基因疾病是由单一基因异常引起的，并以传统孟德尔模式遗传：常染色体显性、常染色体隐性、X连锁隐性、X连锁显性和非传统孟德尔遗传的母系遗传等。以常染色体显性遗传为例，男女子代发病风险均为50%，可能会导致疾病在家族中代代遗传的现象。

单基因遗传病发生的主要原因是基因序列的改变导致蛋白质数量或功能异常。可能存在单个错义突变（将一个核苷酸换成另一个）、一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的缺失、基因部分的扩增或基因内的其他重排及甲基化异常。根据突变位点的不同，其编码的蛋白质表达受阻，或者其蛋白稳定性、结构可能发生改变，进而导致蛋白质活性发生改变（更高或更低的活性），而不影响蛋白质功能的同义突变绝大多数都是不致病的，但某些看似“同义突变”的变异可能会影响信使核糖核酸（mRNA）的剪接，是致病性的。

一、单基因遗传病遗传模式与家系分析原则

常染色体显性遗传病是22对常染色体中的一对基因中的一个发生异常的结果。患有常染色体显性遗传病的个体，其子代有50%的机会遗传其异常变异并表现出表型。在部分情况下，没有家族史的患者，可能是新发突变所致。因此，没有阳性家族史并不排除常染色体显性遗传病。通常，常染色体显性疾病涉及结构蛋白或相关受体，其家系内可能存在表型差异，表现程度不同（表型异质）。例如，受影响非常轻微的父母可能有一个受影响更严重的子代。例如Treacher-Collins综合征是一种表型差异较强的常见颅面疾病，导致这种现象的机理尚不明确。

常染色体隐性遗传病是基因两个拷贝发生异常的结果，分别从双亲传递而来。父母各有一个正常和一个异常拷贝等位基因，为无症状携带者。携带者夫妇每次怀孕都有25%的风险生下受累男婴或女婴。通常，常染色体隐性疾病通常涉及酶类蛋白的合成。这些酶缺乏导致先天性代谢障碍以及多发畸形等综合征。例如，Smith-Lemli-Opitz综合征包括小头畸形、腭裂、特征性面部外观、心脏缺陷、男性**异常、多指，以及生长发育和智力发育迟缓，其原因是胆固醇代谢通路发生异常。

X连锁疾病，顾名思义是由位于X染色体上的基因异常引起的。据文献统计，患有X连锁疾病的男性比女性更易发生症状。携带有一个X连锁隐性异常基因的女性可能只有轻微症状或无症状，而男性则表现出完全的症状，这种差异现象是X随机失活所导致，其女性的一条X染色体在发育早期发生了失活。相比之下，患有X连锁显性遗传病的女性会有症状。一些X连锁显性疾病，如Rett综合征，其基因的失活导致男性胚胎发育发生阻滞。在X连锁遗传中，由于男性子代从母亲那里获得X染色体，携带者母亲的每个男性子代都有50%的机会遗传异常基因，其女性子代都有50%的概率遗传异常基因而成携带者，50%的概率遗传正常基因。而一个患有X染色体连锁疾病的男性如果能够生育，就会将异常的X连锁等位基因传给他的每个女性子代，她们将成为致病基因的携带者，而男性子代都不会继承其异常基因（儿子从父亲那里承接的是Y染色体）。受累男性通过携带者女儿将缺陷基因传递给外孙，可能有一半的外孙受累，血友病就是一种X连锁遗传的典型例子。

二、经典单基因病检测技术

目前已被美国国家生物技术信息中心（NCBI）正式收录的相关基因有23 000多种，分子机制明确的有4 500多种，包括常染色显性、隐性及X连锁遗传病。单基因病虽然发病率低，但是种类多，所以合并数量众多，对患者家庭乃至社会造成沉重负担。临**迫切需要对这一类患者及家庭提供有效的检测及咨询，对婚育进行指导，避免遗传病的再发。随着遗传学和分子生物学技术的发展，越来越多的疾病基因或候选基因被识别，基因突变与疾病的关系也逐渐明确。基因诊断已经逐步应用于临床。目前用于检测基因突变的方法很多，如Sanger测序、MLPA、实时荧光定量PCR、高通量测序（NGS）等。

（一）Sanger测序

Sanger测序也称为双脱氧测序或链终止反应。它是基于添加双脱氧核苷酸（ddNTPs），通过DNA聚合酶，用于扩增反应。不同颜色荧光团标记ddNTPs使自动化DNA测序成为可能。在这种技术中，经过一系列的扩增后，片段被分离纯化以去除未结合的游离荧光成分，然后通过毛细管分离电泳。最后将结果与数据库中参考序列进行比较。

Sanger测序是被广泛用作分子诊断的金标准，也用作高通量测序结果的验证。它可以检测序列上的点突变和微小插入/缺失变异，并且需谨慎解释其测序检出的结果。在隐性遗传的疾病中，由于可能影响基因诊断（尤其是遗传咨询和产前检查诊断）的结论，所以需家系验证其两种致病性突变是否位于不同的等位基因（反式）。如果两种突变都存在于同一等位基因（顺式）中，受检者还有另一个未知的突变没有检测到，一般用其父母双方的DNA进行测序分析。此外，在对意义未明的变异进行诊断报告前，其对剪接或蛋白质活性或定位可能的影响需要进行计算机预测分析，选择性剪接位点可以通过RNA水平的cDNA测序进行验证。

（二）多重连接探针扩增技术（MLPA）

MLPA是一种高通量探针连接后的PCR扩增技术，这些方法是基于将不同长度的探针与目标序列杂交，然后通过连接酶将杂交后的引物连接并进行PCR扩增，随后通过毛细管电泳分离扩增片段，并通过分析受检者样品和对照样品之间峰值信号的高低进行运算，获得待检测片段的拷贝数。MLPA能够检测异常拷贝数变异，如基因组序列中缺失和重复片段。逆转录MLPA（RT-MLPA）和甲基化特异性MLPA（MS-MLPA）是该技术的另外应用方向，用于mRNA表达水平和甲基化水平的分析。

MLPA检测的一个重要的局限性，在于遗传变异对探针杂交效率的影响。探针与目标序列的不匹配，可能导致探针信号的降低或丢失，进而错误地判断其片段缺失。因此，有必要使用另一种方法或使用一组不同的探针进行结果确认，尤其是缺失片段中只涉及一个探针时。建议对探针覆盖的外显子进行序列分析，确定患者在该区域存在的未知致病性基因变异。

（三）实时荧光定量PCR（Realtime PCR）

实时荧光定量PCR基于PCR扩增的同时对荧光标记靶序列进行检测或定量。其主要应用于4SNP基因分型、拷贝数变异（CNV）分析和基因表达等。

荧光标记有两种主要策略：双链DNA（dsDNA）结合染料和荧光标记引物或探针，其中最常使用的双链DNA染料为SYBR green。它非特异性地与双链DNA结合并发出比染料在溶液中游离时强得多的荧光信号。其设计分析相对简单，并且具有较低的经济成本。此外，它还可用于分析溶解曲线、荧光图强度与温度的关系，并检查扩增子的特异性。然而，由于它所使用的荧光是单个通道发出的，因此仅限于分辨单个扩增反应，其非特异扩增和引物的扩增二聚体也会影响其定量分析。关于标记探针检测，应用最广泛的属于Taqman探针。由于探针是由5’端的荧光报告染料和3’端的猝灭染料组成，具有特异性的靶向寡核苷酸。未扩增前的探针，其报告荧光基团因其接近猝灭剂而发生猝灭。在扩增过程中，探针与DNA杂交并被聚合酶的5’和3’端核酸外切酶活性切割，荧光基团释放，并随着扩增片段数量的增加，其释放的报告基团和荧光信号成比例增加。虽然Taqman探针比双链DNA染料更加昂贵，但可以提高检测通量、降低成本，并缩短多重反应的检测分析时间，而且它对低拷贝数的目标序列检测也更加敏感。

（四）高通量测序（NGS）

在过去的40多年中，Sanger测序，无论是凝胶测序还是毛细管测序电泳，都被认定为分子诊断中鉴定目标序列变异的金标准。然而，这种通过外显子测序来分析单个基因和外显子的传统分析方法，已经逐渐被更具成本效益和时间效益的替代方案超越。

高通量测序技术，也称为二代测序，允许在短时间内对基因组区域进行测序而且成本相对较低。当前存在着不同原理的平台，使用不同的化学反应，可以对数以百万计的DNA小片段进行并行测序。其中应用最广泛的包括：罗氏454平台使用的焦磷酸测序法；Solexa平台的边合成边测序法（现Illumina）；基于离子pH改变的半导体测序技术（Thermo Scientific）；华大平台的边连接边测序法。这些方法尽管有其内在差异，但都依赖于由短DNA片段组成的DNA文库进行测序，然后根据参考基因组序列进行排序和组装，因此生物信息学成为数据分析中非常重要的一部分。

NGS的应用包括对PCR扩增的基因组区域进行测序、全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）。其中对于产前运用全外显子组测序的解读还有很多问题需要解决，其中包括检出大量的临床意义未明的变异。当向患者报告临床意义未明的变异时，可能会引起他们严重的焦虑，并使临床决策具有很高的挑战性。不同的产前诊断中心依赖于自身的实验室报告，这些报告可能具有较大的室间差异。并且报告依赖于实验室人员单个的文献搜索，这可能导致分析流程烦琐，耗时且范围有限。鉴于未来越来越多的家庭要求采用WES/WGS对胎儿先天性异常进行基因诊断，并且大多数与特定胎儿表型相关的系统分类变异基因都很少，因此有迫切的科学研究需求，需要对产前胎儿基因组的相关基因和变异进行校正。虽然WGS当前不是常规临床诊断的一部分，但在研究复杂疑难疾病中的病因中体现出巨大的价值。另外，WGS由于其成本的不断降低，已成为许多地方的常规诊断程序，未来可能成为分子诊断的首选。伦理方面与偶然发现的变异披露有关（即发现致病性），然而与目标表型无关联的基因致病性突变是WES检测报告的主要挑战之一。

NGS在人类遗传性疾病的分子诊断方面具有广泛的临床应用价值，包括单基因疾病、多基因疾病、基因组疾病等。例如靶向测序，其主要优点是可以在疑似某种疾病的条件下，同时分析导致其表型的众多基因。对于WES而言，可以在没有明确临床诊断的情况下，对所有基因的外显子进行筛查并确定其遗传诊断。连同WGS方法，这些技术正在协助我们对罕见的孟德尔疾病进行致病突变的鉴定，并扩大这类罕见综合征型疾病的表型谱。

三、单基因病与胎儿发育异常

（一）地中海贫血

地中海贫血简称地贫，为一组常染色体隐性遗传性溶血性疾病，是全球广为流行的常见遗传性疾病，我国以南方为高发区，尤以广西、广东两省较为严重。地中海贫血以α或者β珠蛋白链合成障碍为特征，其中最为常见的是α地贫与β地贫。其中α地中海贫血（αthalassemia）有两种临床类型：血红蛋白Bart’s水肿胎儿（Hb-Bart’s）综合征和血红蛋白H（HbH）病。前者由于缺失所有的4个α珠蛋白基因，后者最常见的原因是3个α珠蛋白基因缺失或点突变。Hb-Bart’s综合征是其中最严重的类型，特点是胎儿期发病，全身水肿、胸膜腔和心包积液，严重的低色素性贫血，见于没有ABO血型或Rh血型不相容的情况。其他临床特征包括：明显的肝脾肿大、髓外造血、脑积水、心脏和泌尿生殖系缺陷。通常在新生儿期发生死亡。HbH病的特点是小细胞、低色素溶血性贫血、脾肿大、轻度黄疸，时有地中海贫血式的骨骼变化。患有HbH病的个体可能会患胆结石，在应答氧化药物和感染时发生急性溶血。

β地中海贫血（βthalassemia）的特征是血红蛋白β亚单位合成减少，导致小细胞性低色素贫血，外周血涂片上可见有核红细胞，血红蛋白定量分析时显示成人血红蛋白（Hemoglobin A， HbA）含量降低。患重型地中海贫血的个体表现为严重的贫血和肝脾肿大，通常在出生后头两年需就医。如果不治疗，受累的患儿生长发育严重滞后，预期寿命缩短。通过规律的输血和减少输血所致铁超载的驱铁治疗，可以获得正常的生长发育，大大改善预后。中间型地中海贫血患者出现症状较晚，只有轻度的贫血，不需要规律的输血治疗。这些患者可能因继发性的肠道铁吸收增加，又不能有效地造血而带来铁超载的风险。

1.地中海贫血发病机制

地中海贫血发病的主要原因是由于珠蛋白基因缺失或者突变造成一种或几种珠蛋白肽链合成障碍引发病症，使得血红蛋白中的α珠蛋白和β珠蛋白比例严重失衡，由于基因的缺失造成α和β珠蛋白链合成速度失去平衡引发的贫血。地中海贫血的基因型和表现具有多样化特征，有α型、β型、δ型和δβ型四种，而α和β两种类型最为普遍。根据其基因型和病情轻重分为重型、中间型和轻型三种。

2.地中海贫血临床诊断标准

（1）β地中海贫血。年龄大于12个月的先证者，可以建立β地中海贫血的诊断，包括小细胞性低色素贫血的血液学异常、外周血涂片显示有核红细胞以及血红蛋白分析揭示HbA量降低和HbF升高。年龄小于12个月的先证者，β地中海贫血的诊断也可以确立。新生儿筛查阳性或提示性结果：在出生时检测不到HbA，可以诊断为β0型地中海贫血（曾被称为库利氏贫血，此型患者没有β珠蛋白合成）；在新生儿期，依靠筛查不可能明确地诊断β+型地中海贫血（此型患者有β珠蛋白合成，但量较少），因为HbA量虽然降低但仍在婴儿的正常值范围内；外周血涂片检测到小细胞性低色素红细胞和有核红细胞；HBB基因检测到两个致病性变异等位基因。

（2）α地中海贫血：Hb-Bart’s综合征的诊断依据：严重的大细胞低色素性贫血，无ABO或Rh血型不合；网织细胞增多，可大于60%；外周血涂片上有大量低色素红细胞、异嗜红细胞和大量的有核红细胞；血红蛋白分析显示血红蛋白A含量减少或完全缺失，血红蛋白Bart’s含量增加；HBA1和HBA2中所有四个α-珠蛋白基因缺失或失活（例如，两条染色体上的HBA1和HBA2纯合子缺失，-/-），并进行家系验证。HbH疾病诊断依据：轻度至中度（罕见严重）小细胞低色素性溶血性贫血；中度网织细胞增多（3%~6%）；外周血涂片见异嗜红细胞增多，以及极少数有核红细胞；新鲜血液涂片经1%灿烂甲酚蓝孵育1~3小时后，可见HbH包涵体红细胞；血红蛋白分析提示0.8%~40%的HbH和60%~90%的血红蛋白A；基因检测HBA1和HBA2中，三个α珠蛋白基因缺失或失活，并进行家系验证。

3.地中海贫血治疗

重型地中海贫血：定期输血可以纠正贫血，抑制红细胞生成，抑制胃肠道对铁的吸收。在开始输血之前，必须进行乙肝疫苗接种和进行深入的红细胞抗原类型分析，包括Rh、Kell、Kidd和Duffy血型以及血清免疫球蛋白测定。血清免疫球蛋白测定确定患者是否有IgA缺乏症，因为他们准备输血之前需要特殊的血液准备（反复洗涤）。输血方案是特别设计的，通常每两到三周输血一次，维持血红蛋白（Hb）浓度为95~100g/L。

中间型地中海贫血：对患有中间型地中海贫血症的患者进行治疗的主要手段是脾切除术和叶酸补充，也可通过骨髓移植和脐血干细胞移植对患者进行治疗，治疗时需预防输血后铁过载、心脏疾病和骨质疏松等继发症。

4.再发风险与产前诊断

β地中海贫血与α地中海贫血都是以常染色体隐性遗传方式遗传。理论上β地中海贫血受累个体的同胞受累的风险为25%，50%的概率为无症状的携带者，其余的25%为完全正常。杂合子（Heterozygotes，即携带者）可能有轻微的贫血，但没有任何临床症状。携带者通常被称为轻型地中海贫血症。建议对高危人群（包括家庭成员、配子捐献者和高危族群的个体）进行携带者筛查。一旦在高危的夫妇中确定了HBB的两个致病变异，需行产前诊断或胚胎植入前基因诊断。

对于α地中海贫血，理论上来说，每个Hb-Bart’s综合征患者的同胞有25%的概率为Hb-Bart’s综合征，50%的概率为α地中海贫血特征，2个顺式基因缺失或失活（-/αα），还有25%的概率完全正常。如果父母一方为α地中海贫血特征，有2个顺式α基因缺失（-/αα），另一方是α地中海贫血沉默携带者（1基因缺失，-α/αα），子女为HbH病患者，每个同胞有25%概率为HbH病、25%的概率为α地中海贫血特征、25%的概率为α地中海贫血沉默携带者，还有25%的概率完全正常。

通过选择合理合适的产前筛查和产前诊断技术，不仅对地中海贫血高危孕妇胎儿基因进行早期诊断，减轻患者的痛苦，而且对今后采取措施预防和控制重症地贫儿的出生，提高人口质量起到积极的作用，同时对保障母体安全，减轻家庭和社会负担具有重要意义。

（二）软骨发育不全（Achondroplasia）

1.临床表现

软骨发育不全是一种儿童致死致残性生长发育障碍性疾患。患者有非匀称性身材矮小、大头畸形及相关特殊面容（伴有额头隆起、面中部后凹和鼻梁塌陷）。婴儿期典型表现为肌张力低下和运动发育迟缓。尽管颅颈交界处受压会增加婴儿死亡的风险，但智力发育和预期寿命通常接近于正常水平。其他并发症还包括阻塞性睡眠呼吸暂停、中耳功能障碍、脊柱后凸和椎管狭窄。

2.发病机制

软骨发育不全属于常染色体显性遗传性疾病，成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）基因是其主要致病基因。FGFR3基因编码蛋白是编码人类4种成纤维细胞生长因子受体之一，这4种受体都是影响细胞增殖的细胞表面受体。FGFR3蛋白由具有3个免疫球蛋白样区域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内酪氨酸激酶组成，其在软骨细胞膜上广泛表达，作为一种负调节因子抑制软骨成骨，从而影响长骨的生长发育。当FGFR3基因发生功能获得性突变时，引起FGFR3蛋白配体独立激活并释放抑制信号，进而导致软骨发育不全的发生。

3.诊断标准

软骨发育不全的患者具有典型临床表现，影像学表现为头颅顶部增大，全身管状骨变短、增粗、骨干骺端改变，骨皮质密度增高，尾椎椎弓根间距狭窄，髂骨变圆，髋臼宽而平，坐骨小切迹狭窄，等等，通常可做出临床诊断，并建议行FGFR3基因检测进一步确诊。Krakow等团队描述了孕期从16~28周孕龄使用三维超声检查来加强对面部特征、四肢骨骼和肢体相对比例进行评估；Chitty发表了软骨发育不全胎儿的各种超声影像特征及频率。

4.治疗

本病尚无特效治疗，一般需要多学科团队合作予以对症处理。生长激素曾作为软骨发育不全患儿改善矮小的一种治疗方法，但研究发现其对于成年终身高的改善不显著，平均成人身高增加约3cm，不常规推荐使用。

5.再发风险与产前诊断

软骨发育不全以常染色体显性方式遗传。大约80%的软骨发育不全患者是新发突变致病变异所致，其父母通常身高正常。这样的父母再有一个患有软骨发育不全的孩子的风险很低。患有软骨发育不全的个体，如果与一个身高正常的伴侣有生育需求时，其每次怀孕有50%的风险生下一个患有软骨发育不全的孩子。当父母双方都患有软骨发育不全时，其子女正常身高的概率为25%，发生软骨发育不全的风险为50%，其纯合子型软骨发育不全（致死性）的风险为25%。如果在患病的父母中发现FGFR3致病性变异，则可以行胚胎植入前诊断或对胎儿行产前诊断。