一、染色体核型分析
染色体核型分析技术是目前常用的染色体病诊断技术。胎儿染色体核型分析是通过羊膜腔、脐血管和绒毛膜穿刺获取胎儿细胞，经体外培养后收获、制片、显带，进而进行染色体核型分析。染色体显带技术是染色体标本经过一定处理，并用特定染料染色，使染色体显现明暗或深浅相间的横行带纹。通过显带技术，使各条染色体都显现出独特的带纹，这就构成了染色体的带型。每对同源染色体的带型基本相同而且稳定，不同对染色体的带型不同。根据染色体的化学结构及在细胞分裂的不同时期的特点，衍生出了Q、G、R、C、T、N等显带技术，建立了相应的染色体核型分析技术类型。
（一）不同的显带技术及相应特点
1.最先建立的是Q显带（Q-banding），借助于喹吖因荧光染料染色体标本进行染色，在荧光显微镜下观察发现，染色体的不同区域显示强弱不等荧光，揭示了人类各条染色体独特的荧光带型。但Q带存在一定的局限性，其需要在荧光显微镜下进行观察，而且喹吖因荧光染料荧光保存时间短，不能长期保存，需立即观察。因此，现在几乎不使用。
2.G显带是染色体核型分析中最经典、最常用的检测方法。
G显带由Q显带技术改进而来。将染色体标本用碱、蛋白酶或其他盐溶液处理，使染色体上的蛋白质变性，再用吉姆萨（Giemsa）染液染色，光学显微镜下即可观察到深浅相间的带纹，易着色的阳性带（Positive Band）（深带）为富含A—T的染色体节段；不易着色的阴性带（Negative Band）为富含G—C的染色体节段。普通G显带为320~550条带分辨率。目前，国际统一使用且不断更新了人类细胞遗传学命名并系统描述G显带染色体区、带的标准，与人类基因组变异协会（HGVS）基因变异命名规则进行对接，通过与其比对，即能判定染色体是否发生了畸变。G显带不仅可以对染色体数目及结构进行全景原位分析，一览染色体核型全貌，而且在平衡易位等结构异常中具有无可比拟的优势，目前尚无法被二代测序、基因芯片技术等技术手段所取代。
G显带可拓展到550~850条带纹，甚至2 000条，能提高分辨率发现更微小变异，称为高分辨显带技术（High Resolution Banding，HRB）。高分辨染色体由于在带纹中增加了亚带，从而增加了染色体带纹的分辨率。故对用一般G显带分辨有困难的染色体异常，用高分辨染色体技术判定断裂点就更为确切了。但由于操作烦琐、成本较高，且随着分子遗传学技术的不断进步，高分辨染色体技术目前的使用并不普遍。
3.C显带、T显带及N显带常用于染色体特殊结构的检测。
C显带在染色体着丝粒区域和其他包含结构异染色质（主要包含有与着丝粒相邻的1q、9q、16q三个区域及Yq区域的末端）的区域深染，而其他区域浅染。因此，对于1qh+、inv（9）（p12q13）、16qh+、inv（Y）（p11.2q11.2）等特殊结构的异常，C显带可成功检出。T显带经吖啶橙染色后可将端粒深染，主要用于检测端粒变化。N显带是通过银染法（Ag-As技术）专门显示核仁形成区（Nucleolus Organizing Region，NOR）的显带技术。人类近端着丝粒染色体的随体间易发生联合，这种联合可能是造成近端着丝粒染色体不分离、断裂和易位的主要原因。通过N显带可以清楚地观察到被检测样本是否含有银染近端着丝粒染色体联合，从而准确判断人体细胞是否存在双随体小染色体或者其他的随体异常，如随体柄增加（pstk+）、随体增大（ps+）、双随体（pss）、双随体柄（pstkstk）、Y染色体长臂或者其他染色体末端出现随体（Yqs）等。
（二）产前应用指南
1.对于无创产前筛查（Non-invansive Prenatal Testing，NIPT）提示13、18、2号染色体或性染色体数目异常，采用G显带核型分析技术进行产前诊断。
2.早孕期超声异常胎儿，如NT增厚、鼻骨未显示、全身皮肤水肿、颈部水囊瘤、淋巴水囊瘤、脐膨出、全前脑、露脑畸形等与胎儿染色体异常密切相关的超声指标，可通过G显带核型分析技术尽早对胎儿染色体异常进行诊断。
3.对不明原因反复流产的夫妇，可通过G显带核型分析观察该对夫妇的染色体核型是否存在平衡易位的情况。
4.平衡易位携带者的胎儿，需用G显带核型分析技术确定胎儿染色体变异情况。
（三）染色体核型技术的优点
1.G显带核型分析技术是染色体产前诊断的金标准。其通过直接观察染色体的方法进行检测，可以对染色体数目及结构进行全景原位分析，一览染色体核型全貌。
2.G显带核型分析技术是染色体异常最经典的检测方法，它的优势在于其检测范围覆盖整个染色体组，能检测到大片段（大于10Mb）的缺失、插入、平衡易位、倒位、重排等。
（四）染色体核型技术的缺点
1.G显带核型分析技术常受到细胞培养成功率、细胞分裂指数、标本质量及操作者经验水平的影响。
2.G显带核型分析技术不利于快速诊断，也不能检出染色体的微小缺失及微重复（小于10Mb）。
（五）应用前景
染色体病归根结底是由于染色体内的基因组DNA改变引起的疾病。建立在细胞遗传学基础上的染色体核型分析技术是以通过直接观察染色体的方法，检测其数目和结构改变，并不能直接检测基因组DNA的改变，其分辨率较低，在实验过程中存在诸多影响因素，操作者的经验和技术操作水平不同也会影响分析结果。基于分子遗传学技术的FISH、CMA、CNV-seq、高通量测序技术等以基因组DNA为检测靶标，直接检测基因组DNA的改变，提高了检测分辨率，减少了对结果的影响因素，但不易辨认染色体平衡易位等结构变异。在临床工作中，染色体分析技术各有所长，在日常工作中可将染色体核型分析技术与其他分子遗传学技术联合应用，可提高诊断的准确性，防止误诊、漏诊。
二、荧光原位杂交
荧光原位杂交即FISH，此技术是用荧光素标记DNA探针，再与玻片上染色体特定位点结合，进而检测染色体数目和结构异常的一类技术。FISH技术在产前诊断领域，特别是快速诊断方面已经起到了很好的作用。2020年，国家卫生健康委员会临床检验中心产前筛查与诊断实验室室间质评专家委员会和新生儿遗传代谢病筛查实验室室间质评专家委员会组织专家制定了《产前荧光原位杂交技术专家共识》。
（一）应用范围
1.FISH可用于检测未培养的绒毛、羊水和脐血样本。由人类13号、18号、21号、X及Y染色体数目异常而导致的疾病，包括21三体综合征（Down综合征）、18三体综合征（Edward综合征）、13三体综合征（Patau综合征）、45,X（Turner综合征）、47,XXY（Klinefelter综合征）、47,XXX以及47,XYY七种疾病。这些疾病占所有染色体病的65%~80%，是常见的染色体非整倍体异常。因此，基于13号、18号、21号、X及Y染色体的FISH检测，在产前诊断中的应用已十分普及。
2.FISH也可用于检测自然流产以及因产前诊断显示异常核型行流产术后取得的胎儿组织样本。早期流产中胚胎染色体异常占50%~60%，染色体的异常中数目异常大约占86%（包括单体、三体和多倍体），结构异常占6%，其余的8%为单个基因的突变或嵌合体。45,X、16三体、18三体、21三体、22三体、13三体等为最常见的染色体非整倍体异常。流产组织中，13、16、18、21、22、X、Y染色体的FISH检测已应用广泛，可对该次流产的原因及时做出判断，并对指导下一次生育有重要意义。
3.染色体微缺失综合征是一组由于染色体微小缺失造成的一系列综合征的总称，在围产儿和新生儿中发病率较高。选择相对应的探针，也可以通过FISH进行检测。目前FISH可以检测的微缺失综合征主要包括22q11微缺失综合征、X连锁鱼鳞病、猫叫综合征、Angelman综合征、Prader-Willi综合征和Williams综合征等。
4.FISH可用于嵌合体的检测。对于染色体核型分析与DNA芯片检测存在争议的真假嵌合体，可用FISH检测明确。
（二）产前应用指南
1.对于NIPT提示13、18、21号染色体或性染色体数目异常，需要进一步明确诊断者，可通过该项技术快速做出诊断。
2.对于孕周过大、染色体核型分析培养失败或其他原因不能行细胞遗传学产前诊断者，FISH可作为补救诊断手段之一，提供常见染色体非整倍体异常的检测。
3.FISH技术也可以和染色体核型分析技术联合应用，有助于尽早获得胎儿常见染色体数目异常的信息。
4.某些染色体微缺失综合征，可选择相应探针，进行FISH检测。
5.对于染色体核型分析不能观察到的染色体末端小片段（需大于500kb）平衡易位患者，可用其绒毛、羊水和脐血样本通过特定的端粒探针进行检测，确定这一易位片段是否存在增多（部分三体性）或减少（部分单体性）。
（三）FISH技术的优点
1.安全，探针稳定性高，定位准确，特异性好。
2.FISH对样本要求比较低，对于羊水量少、羊水活细胞数目少、孕周偏大、细胞培养失败等各种原因导致的核型分析失败可在一定程度上给予弥补。
3.FISH实验周期短，具有速度优势，能在24~72小时快速确定常见的染色体非整倍体异常，有效缓解孕妇和家庭的忧虑。
（四）FISH技术的缺点
1.FISH技术难以检出低比例的嵌合体。胎儿体内嵌合细胞的比例，将决定杂交信号的检出率。对于比例较低的嵌合体，FISH难以做出精确判断，必须结合核型分析结果来全面判断。
2.FISH探针需要特定设计和制备，无法检测目标结构区外的异常。
（五）FISH技术的应用前景
近年来，随着DNA技术的不断发展，大量的荧光素标记的染色体特异性探针出现，加之FISH实验周期短的优势，现阶段FISH技术在产前诊断领域有着重要的作用。
三、Bionano全基因组光学图谱
Bionano全基因组光学图谱，是一种基于单个DNA分子有序的全基因组限制性内切酶酶切位点图谱。Bionano全基因组光学图谱技术利用单链内切酶对DNA进行识别酶切并标记荧光，再利用微流控技术把DNA分子拉直，将每个DNA单分子线性化展开，进行超长单分子高分辨率荧光成像，即生成了一幅酶切位点分布图。这些极长读长片段组装和拼接的基因组，克服了传统的使用小于重复单位的读长片段来组装完整的重复区域的不可靠性。通过为每个染色体臂的每个单倍型绘制单个图谱，复杂的重排可在单个连续图谱中显示出来。
（一）检测的基本流程
（二）应用范围
1.现临床常见的适应范围为面肩肱肌营养不良（大片段D4Z4区域的重复、染色体来源）、血友病［F8基因中内含子22（inv22）和内含子1（inv1）的倒位］及某些遗传病的分子诊断。
2.未知的结构变异（如反复性流产中可能存在的平衡易位或临床高度怀疑的染色体结构变异所致的遗传病），全基因组测序（WGS）或全外显子组测序（WES）检测阴性的患者，可用此技术进一步探究原因。
（三）临床运用价值
1.可用于产前诊断染色体非整倍体检测及染色体结构变异检测。
2.可检测产后遗传病可能存在的结构变异。
3.对于反复性流产者中可能存在的平衡易位或临床高度怀疑遗传病，而染色体核型检测未见异常、WES检测阴性的患者，可用此技术进一步检测。
（四）Bionano全基因组光学图谱技术的优点
1.可用于产前诊断染色体小片段异常，或产后遗传病可能的复杂结构变异检测。
2.敏感性好、准确率高、重复性好，能检测低比例的复杂结构变异。
3.运用单分子DNA荧光标记，可做到超长读长，无PCR的样本保真性更高。
4.自动化流程，图表化结果，确保数据结果准确性与可靠性。
（五）Bionano全基因组光学图谱技术的缺点
1.对于酶切位点未覆盖的区域检出能力有限。
2.此技术原理是覆盖特异性酶切位点（甲基化转移酶标记），没有分子标记的区域可能会漏检，比如此技术非染色体拍照技术，近端着丝粒短臂无标记，无法有效检测罗伯逊易位；也非测序技术，无法检测小的变异，如点突变，小的插入缺失（500bp以内），因此需要和核型分析或二代测序或其他测序技术组合使用。
3.缺乏应用共识或指南，对于海量的结构变异分析有一定难度。
4.成本较高，临床直接应用有待成本的进一步降低；操作比较繁杂、费时。
（六）应用前景
Bionano全基因组光学图谱技术目前主要用于不良妊娠结局的原因查找，针对传统或前期已有技术无法解决的结构变异，结合现有技术，提高临床的检出率，找到结构变异与不良妊娠结局或出生缺陷的关系。此技术可以解决某些技术不能解决的复杂异常，可能随着技术的发展逐步替代芯片、CNV-seq技术在产前的应用。目前，随着结构变异研究的深入，中等大小的基因组复杂结构变异在临床遗传病种占到难以预估的比例，通过Bionano光学图谱平台结合WES，可实现对人类基因组多种变异类型的全面覆盖，不仅可明显提高临床检出水平，同时有望发现新的结构变异与疾病之间的关系，从而拓展科研思路。
四、植入前非整倍体检测（PGT-A）、植入前染色体结构重排检测（PGT-SR）
胚胎植入前遗传学检测（Preimplantation Genetic Testing，PGT）技术，是指在常规试管婴儿治疗过程中，应用该技术对植入母体子宫之前的胚胎进行基因检测或染色体数目及结构异常的检测，选出正常的胚胎进行移植，防止单基因病和染色体异常患儿出生。
植入前非整倍体检测（PGT for Aneuploidies，PGT-A）是针对染色体非整倍体的胚胎筛查，用来检测一个或多个染色体的获得或丢失。植入前染色体结构重排检测（PGT for Chromosomal Structural Rearrangements，PGT-SR）用于胚胎染色体结构异常的检测。
（一）应用范围
1.PGT-A用以检测胚胎一个或多个染色体的获得或丢失，从而筛选出染色体数目正常的胚胎。
2.若夫妇任一方或双方携带染色体结构异常，PGT-SR可检测出结构异常胚胎，从而达到筛选胚胎的目的。
（二）产前应用指南
1.PGT-A适用于女方高龄、不明原因反复自然流产、不明原因反复种植失败、夫妇双方核型正常但有多次流产史、严重畸**症等。
2.PGT-SR适用于夫妇任一方或双方为染色体结构异常携带者，包括相互易位、罗伯逊易位、倒位、复杂易位、致病性微缺失或微重复等。
（三）PGT-A与PGT-SR技术的优点
1.非整倍体和染色体非平衡的结构异常是反复自然流产和反复种植失败的主要原因，PGT-A和PGT-SR可以降低流产和孕育非整倍体胎儿的风险。
2.PGT-A与PGT-SR技术均将胎儿的诊断提前到着床前的胚胎阶段，可有效预防不良胚胎着床及非意愿性流产带给孕妇身体、心理及家庭等方面的重大创伤。
（四）PGT-A与PGT-SR技术的缺点
1.通过PGT-A与PGT-SR检测的胚胎，虽然可大大降低不良妊娠结局，但受到胚胎嵌合体、检测技术、环境、药物等影响，仍然不能100%避免出生缺陷，因此必须在孕中期进行产前诊断。
2.传统的PGT胚胎活检均为有创性操作，可能因胚胎细胞丢失而对胚胎的活力及着床产生潜在的影响。
3.PGT检测的是单一或少数囊胚阶段的细胞，不是直接检测形成胎儿的细胞，因此可能产生误差，需要对胎儿进行产前诊断，尽可能避免没有检测到的胎儿遗传缺陷。
（五）应用前景
PGT-A与PGT-SR技术可选择合适的胚胎植入母体而获得健康的子代。随着PGT-A与PGT-SR技术在临**的成熟应用和普及，规模不断提升，已无可争议地成为阻断出生缺陷的利器。随着基因组检测的普遍化和大众对生殖风险认识的提高，对胚胎进行多种PGT筛查和诊断的需求也在增加。临**，对于有多个临床指征的同一对夫妇，例如夫妇既有单基因疾病PGT指征，又有女方高龄，同时符合PGT-M和PGT-A的标准，进行联合PGT（combination-PGT，cPGT），可显著降低植入失败、早期流产和染色体异常的风险。随着测序成本的持续下降，通过算法改进和实验体系优化，在一次检测中同时快速准确进行PGT-A、PGT-SR和胚胎植入前单基因遗传学检测（PGT-M）的全面PGT （comprehensive PGT）已成为可能。
传统的PGT胚胎活检均为有创性操作。尽管研究表明，进行单个卵裂球或少量囊胚滋养细胞活检对胚胎存活率的影响可以忽略，但仍然不能排除胚胎细胞丢失对胚胎的活力及着床有潜在的影响。为了避免对胚胎活检的潜在损害，有关无创PGT（non-invasive PGT，niPGT）的研究已在紧锣密鼓地进行中。niPGT是从囊胚腔或培养基获得的DNA进行检测，以达到无创的目的。niPGT是未来PGT发展的重要趋势，目前的研究还存在样本量过少的问题，亟待更多的科学研究深入探索。
专家提示
① 染色体检测的相关技术是预防出生缺陷不可或缺的重要手段。我们应准确掌握各项技术的优缺点，在日常工作中可将染色体核型分析技术与其他分子遗传学技术联合应用，提高诊断的准确性、及时性。
② 对于反复性流产者中染色体核型检测未见异常、WES检测阴性的患者，可用Bionano全基因组光学图谱技术进一步检测，防止漏诊。
③ PGT-A与PGT-SR技术应用时，需符合产前诊断指征，禁止滥用。
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