在基金会建立后，梅琳达就全身心地投入到基金会的工作当中去了。在盖茨的母亲去世一周年时，比尔·盖茨和梅琳达以母亲的名义向华盛顿大学捐助了1000万美元，建立起了玛丽·盖茨奖学金。因为盖茨的母亲死于癌症，所以盖茨在生物科技领域作了大量的捐助和投资。他曾经向西雅图的癌症研究中心捐助了100万美元，用以推动他们的医学研究，希望他们能够研究出攻克癌症的方法，以挽救像盖茨母亲这样的癌症患者的生命。此外，比尔和梅琳达基金会还投入了大量资金用来研究疫苗、艾滋病和其他疾病的治疗方法。

1999年，比尔·盖茨已经拥有850亿美元的家产，相当于匈牙利、冰岛和卢森堡三个国家当年的国民生产总值。这时候，比尔·盖茨的财富达到了富可敌国的程度。比尔·盖茨在那时就公开表示，他和梅琳达不会给自己的三个子女留下很多的钱，在他们死后，只给自己的孩子留下几百万美元的遗产，其余部分，都将捐赠给慈善机构。

虽然盖茨与妻子都很疼爱自己的孩子，但是他们从来不会随意满足孩子们的要求，或者给孩子一大笔零用钱。在这方面，他们绝对算是一对吝啬鬼。盖茨的儿子菲比在小的时候就经常抱怨父母不给自己买他最想要的玩具车。盖茨认为，最明智的父母就是不要将钱留给子女，而是应该捐给那些最需要钱的人。在盖茨看来，这是作为公民应有的责任。

梅琳达希望自己做的慈善事业能影响孩子。梅琳达说：“我的孩子们很清楚我们去非洲做什么，他们知道我们是去给当地的孩子送药品和毯子。”

2000年，比尔·盖茨和梅琳达将他们原来建立的两个基金会合并在一起，成立了“比尔·盖茨和梅琳达·盖茨基金会”，合并后盖茨又向基金会捐助了60亿美元，使得这个基金会成为了世界上最大的慈善基金会。这个基金会的总部设在西雅图，一共有大约200名工作人员，其捐资主要集中在两个领域——卫生保健和教育领域。因为盖茨和梅琳达认为这是缩短世界贫富差距的关键。

2002年盖茨到印度进行访问，受到了印度总理杰帕伊的接见，他们在一起还商谈了有关在印度控制艾滋病蔓延的问题。随后在11月11日，盖茨在印度的新德里宣布，他们的基金会将向印度捐助1亿美元，用来预防和治疗艾滋病，从而控制艾滋病在印度的蔓延。

在基金会成立之初，梅琳达与盖茨曾经向非洲资助过电脑。但是后来他来到南非一个贫困地区考察时发现，他资助的电脑在当地根本派不上用场。因为对于当地居民来说，饥饿和疾病使他们的生存都成为问题，根本没有心情关注电脑。

当盖茨和梅琳达查看了1993年《世界发展报告》的内容后，更令他们震惊。梅琳达说：“很多非洲的孩子是死于腹泻或其他非常普通的疾病，凭借简单的接种疫苗完全可以避免这些悲剧。我们意识到这方面的信息还了解得太少，然而，我们知道得越多就越觉得不能再等了。”于是，盖茨就把对非洲援助的方向转为了关注消除饥饿、防治疾病等项目。梅琳达曾经说过：“我们为了把钱用于效果最显著的项目上，经常研究世界最欠缺平等地区的列表。”

2003年，盖茨夫妇再次进入非洲。其间，他们参观和访问了非洲当地的多家医院，并与当地的医护人员及患者进行了亲切的交谈。盖茨和梅琳达希望通过他们的捐助能够使那些贫困地区被疾病困扰的人们从中受益。在盖茨夫妇的捐助下，非洲的儿童在疫苗的接种率方面有了大幅度的提高，取得了很大成效。在非洲的一些国家里，儿童接种疫苗的费用已经从以前的每人不足1美元提高到了现在的10美元。这些疫苗据估计已经挽救了大约30万人的生命，在未来10年，预计挽救的生命将达到上百万人。

2005年1月27日，比尔·盖茨在瑞士举行的世界经济论坛上承诺，他将捐助7.5亿美元用来帮助第三世界国家购买急需的疫苗。

比尔·盖茨夫妇不仅关注疫苗方面的问题，他们对那些无家可归的艾滋病患者和贫困地区的孩子和青年人的生存问题也非常关注。盖茨夫妇除了在经济上和医疗上援助一些贫困的艾滋病患者外，还在当地宣传一些传染病的防治方法，以及让他们认识到艾滋病的危害并了解如何预防艾滋病的传染。他们建立的“青年自立计划”，让当地的青年人学会了如何谋生，并且还免费对他们进行一些技能方面的培训，使无数青年人从中受益。

2003年，比尔·盖茨曾经带着十几名媒体记者和摄影师到津巴布韦考察当地农村的医疗情况。在当地的一个诊所里，盖茨抱着一个婴儿与妈妈们围坐在芦苇席上聊天，询问当地的医疗情况。他为了解当地的性病传播状况甚至还到博茨瓦纳探访了一些妓女，以确定自己将要资助的项目。随行的媒体在报道了当地的情况后引起了有关政府对此类问题的关注。盖茨在津巴布韦访问时还宣布要捐资1.68亿美元用来帮助非洲大陆防治疟疾的肆虐。在比尔·盖茨宣布为非洲捐资后，一些欧洲国家的政府也纷纷响应，决定捐资参与有关非洲疟疾的防治项目。

到2005年，盖茨为了帮助非洲等贫困国家防治疾病和提高当地医疗保健水平已经捐出了60亿美元。在南非的博茨瓦纳这个国家竟然有超过1/3的人口都感染了艾滋病，为此盖茨夫妇立即拿出5000万美元帮助他们国家建立了基础的保健体系。比尔·盖茨之所以选择捐资疟疾和艾滋病领域，是因为在众多疾病中疟疾和艾滋病是最致命的。在非洲每30秒就有一个儿童因为疟疾而失去生命，每7秒就有一个人感染艾滋病。而且，在非洲的贫困国家中每年会有数百万人因疟疾而失去生命。盖茨认为在社会和政府共同的努力下，这一切将会得以改变。而且，盖茨相信在医学技术的发展下，疟疾这一疾病在世界范围内将会被彻底消除。

盖茨和梅琳达在为基金会选择一个新的捐资方向和地点时，他们讨论了两个问题：一个是，在哪方面捐资会影响最多的人？另一个是，在过去他们曾经忽略过哪些问题？比尔·盖茨夫妇在捐款方面非常严格，梅琳达曾经说过：“对所有的不公平我们都会认真审视，并希望在我们的努力下能够通过捐款给他们带来最大的变化。”所以，盖茨对他们投资和捐资的每一分钱都精打细算，物尽其用。有一次，一个南美的申请人曾经建议盖茨为一个村庄的猪和人同时注射疫苗，这让盖茨非常恼火。盖茨认为，在死亡线上挣扎的还有很多穷人，竟然还有人想把钱花在猪身上，这简直是太浪费了。

为了寻找解决人类的疾病问题的方法，盖茨从基金会中拿出了2亿美元，通过借助美国国家卫生研究所的科研能力，来共同寻求解决的办法。为了召集全球最出色的科学家来共同研究人类如何战胜疾病，盖茨基金会与美国卫生研究所将共同启动名为“全球健康挑战”的运动。他们研究的主要方向是，确定哪些疾病是全球面临的最严重的疾病，然后科学家们再进入实质性的研究和开发阶段，寻找攻克的最佳方法。

盖茨夫妇捐款的金额与世界卫生组织的年度开销基本不相上下。其中，大部分的资金都用于预防和治疗人类的疾病，以及援助世界贫穷地区，提升当地的教育水平。曾批评过比尔·盖茨是一毛不拔的铁公鸡的《经济学人》杂志，也因此改变了态度，赞扬比尔·盖茨是慈善事业的新典范。而且比尔·盖茨和梅琳达还被美国的《商业周刊》评选为最受欢迎的慈善家。在慈善事业方面，盖茨通常更注重有关疫苗研究和解决未来问题的科学方案，而梅琳达则更为关注如何帮助病人立即减轻病痛。

比尔·盖茨的基金会对中国也非常关注。2004年，比尔·盖茨与梅琳达基金会被中国批准为合格的境外机构投资者，向中国投资了1亿美元。2004年，基金会还派出专家来到深圳，考察了深圳有关艾滋病的防治能力，并与深圳有关方面进行了探讨。比尔·盖茨认为中国是个有趣的国家，因为中国一方面在接受其他国家的援助，另一方面还援助其他更为贫困的国家。

2007年盖茨基金会在北京开设了一个办事处，并投入了5000万美元用于解决中国的艾滋病问题。盖茨还表示，基金会在防治艾滋病这一计划上将会和中国卫生部保持密切合作。此外，盖茨基金会在农业方面也启动了一些相关计划。因为全球两大水稻研究中心分别在中国和菲律宾，盖茨基金会将通过与亚洲水稻研究人员的合作，研究出适合于非洲的水稻品种，并且想把中国的农业技术引入非洲，帮助非洲提高当地的农作物产量。

比尔·盖茨在2008年曾经表示盖茨基金会将再推出一项新计划来帮助中国人戒烟和对中国乙肝疫苗接种方面进行援助。在2008年中国的四川发生特大地震后，盖茨基金将130万美元捐赠给了中国卫生部，用于地震灾区的疾病控制和水源安全方面的工作。

盖茨也非常注重教育方面的慈善活动，他认为教育对人类来说是非常重要的事情。为了能改善低收入人群的学习条件，比尔·盖茨迄今为止已经投入了十多亿美元，单单向美国的一千多所中学，盖茨的基金会就投入了7亿多美元。在盖茨第九次来到中国时，他代表微软和中国教育部合作启动“携手助学”计划，在中国的中西部欠发达地区建设了一百多间计算机教室。根据微软和教育部的协议计划，微软将在未来五年内投入1000万美元，用以改善中国农村和偏远地区的基础教育。按照计划，微软将首先从农村中小学现代远程教育、师资培训等方面与中国教育部展开合作。

2009年比尔·盖茨以400亿美元的资产再次荣登《福布斯》全球富豪榜首位。比尔·盖茨在近年来的慈善活动中出手阔绰，曾经出资5000多万美元为当地贫困阶层和少数族裔建立了67座中学。在2010年1月29日，比尔·盖茨在达沃斯论坛的发布会上表示，盖茨基金会在未来十年内将会捐赠100亿美元，用于世界最贫穷地区的疫苗研究、开发与应用工作。