1923年秋，陈鹤琴在自己住宅的客厅里，开办了南京鼓楼幼稚园，自己亲任园长，聘请了2位教师，招收了12名流浪儿，开始开展儿童教育实验。

他让自己的女儿当小先生，教流浪儿识字、唱歌；他还和孩子们一起玩识字游戏；甚至还和孩子们一起表演节目。当时我国的儿童教育还是一片荒漠，陈鹤琴留学归国，就在南京创办了5所实验学校和幼稚园，最早在高校开设了儿童心理学课程。

有人在背后议论：“堂堂大学教授，搞娃娃教育有什么出息？”他却回应说：“我就是要从小孩教起！”

他更是用自己孩子为模板，进行教育实验，并归纳总结了科学的儿童观和教育观，开创了中国研究儿童的先河。

1925年，他的《儿童心理之研究》出版，这是我国第一本儿童心理学研究专著。另一本《家庭教育》是前书的姊妹书，更是记载了他对儿子一鸣和女儿秀霞进行教育的心得，因而被陶行知评价为“当今中国出版教育专著中最有价值之著作”，此后几十年中，此书再版了15次。

虽然那时幼稚园开在家中客厅，但他却胸怀大计划：建筑中国化的幼稚园园舍；改造西洋的玩具使之中国化；创造中国幼稚园的全部活动。1925年，新幼稚园舍落成，他和学生、助手张宗麟等，开始开展幼稚园课程、教材、教学法、设备和儿童习惯培养等实验。而他们总结、整理的实验成果，若干年后成为了我国首部《幼稚园课程暂行标准》的核心内容。

当时我国幼儿教育有三种病：外国病、花钱病、富贵病。陈鹤琴和陶行知等新教育倡导者们甚为感慨，希望能将幼稚园课程从外国模式中解放出来，创造符合儿童特点和国情的课程和教法。1926年2月，他和张宗麟等发表了《我们的主张》一文，其中提出了有关幼稚园教育中适合国情、幼儿心理、教育原理、社会现状的15条主张，成为了我国现代幼儿园教育的最早纲领。

1940年，年近半百的他又创建了我国第一所幼稚师范学校，学校没有门和围墙，只在两颗松树间横了一个写着“国立幼稚师范学校”的牌子，字下面画了一只红色的小狮子。他常对学生会说：“我们的幼师，就像一头觉醒的小狮子。”他自封为“老狮子”，在这荒山上与师生们边教学边劳动。学生的印象里，他就是“那个穿着工装裤，白衬衫，满脸红光，精神抖擞的老顽童，总是带着大家又唱又做”。