独立的丧失，土地被剥夺，沉重的赋税负担、劳役和兵役，必然会激起两河流域人民的反抗斗争。公元前522年，当冈比西斯在埃及时，波斯国内发生了推翻冈比西斯统治的事件，最后大流士攫取了王权。这时两河流域人民和波斯统治下的其他地区人民掀起了反对大流士统治和波斯人统治的斗争。在大流士的《贝希斯敦铭文》中说：

当冈比西斯向埃及出发的时候，人民**起来，在国内，在波斯，在米底，也在其他各省，发生了巨大的恶祸。

以后出现了一个人，僧侣玛哥斯，名高墨塔，他在庇什亚瓦德，在名为阿尔卡德里什山的地方暴动了……于是所有的人民，波斯、米底以及其他诸省都**起来，从冈比西斯转而倾向于他。[28]

在大流士夺取了王权以后，包括巴比伦在内的各省人民再次起义反对波斯人的统治。在《贝希斯敦铭文》中说：

当我杀死了僧侣高墨塔之时，有一个人，名阿辛那，乌帕达尔马之子，在埃兰暴动了……还有一个巴比伦人，名尼金图·贝尔，阿尼里之子，在巴比伦暴动了。他这样欺骗人民说：“我是尼布甲尼撒，那波尼德之子。”这时巴比伦人民全部转向这个尼金图·贝尔。巴比伦**起来了，而他在巴比伦取得了政权……此后，我向巴比伦出发攻打自称为尼布甲尼撒的尼金图·贝尔。尼金图·贝尔的军队占据了底格里斯河。他的军队停在那里，船队也就停在那里。于是我令军队坐在皮筏上，另一部分坐在骆驼或马上。阿胡拉·马兹达帮助了我。按阿胡拉·马兹达的意旨，我们渡过了底格里斯河。在那里粉碎了尼金图·贝尔的军队。这是在阿西亚吉加月二十四日，我们进行了会战。此后，我前往巴比伦。在未到达巴比伦之前，在幼发拉底，那里有一个名为扎赞那的城市，那个自称为尼布甲尼撒的尼金图·贝尔带领军队来到这里，要与我会战。以后我们进行了战斗。阿胡拉·马兹达帮助了我。按阿胡拉·马兹达的意旨，我粉碎了尼金图·贝尔的军队。敌人被赶入了水中，水把他们带走了。这是在阿那马卡月二日，我们进行了会战。尼金图·贝尔带领少数的骑兵逃到巴比伦。于是我开往巴比伦。按阿胡拉·马兹达的意旨，我占领了巴比伦并擒获了尼金图·贝尔。以后我把这个尼金图·贝尔杀死在巴比伦。

当我在波斯和米底的时候，巴比伦人第二次叛离了我。有一个亚美尼亚人，名阿拉卡，哈尔吉特之子，在巴比伦名为杜巴拉的地方暴动了。他这样欺骗人民说：“我是尼布甲尼撒，那波尼德之子”。当时巴比伦的军队叛离了我而转向那个阿拉卡。他占领了巴比伦。他在巴比伦成了国王。此后我向巴比伦派遣了军队。我使服从于我的波斯人温达法尔那为军队的长官。对他们说：“去吧，并粉碎那不承认我的巴比伦的军队吧。”温达法尔那带领军队开到了巴比伦。阿胡拉·马兹达帮助了我。按阿胡拉·马兹达的意旨，温达法尔那粉碎了巴比伦人并把他们擒获为俘虏。这是马尔卡德扬那月二十四日，当时他俘获了那个自称为尼布甲尼撒的阿拉卡及其最主要追随者。以后我下命令，把阿拉卡及其最主要的追随者在巴比伦刺死在木桩上。这就是我在巴比伦所完成的。[29]

在希罗多德的《历史》一书中，曾讲到在大流士时期在巴比伦发生起义和起义被镇压的事。希罗多德说，当波斯的海军到萨摩司去的时候，巴比伦又叛变了；他们的叛变是经过非常周密的准备的。原来在玛哥斯僧的统治和七人的政变时期，他们便利用有利的时机和混乱的情况作了对付围攻的准备……他们把他们的母亲送走，再从他们每人的家中随便选出一名妇女来给他们做面包；其余的妇女则被他们集中起来给窒死，为的是不叫她们消耗他们的面包。当大流士听到这个消息的时候，他便纠合了他的全部军队，直指巴比伦进发了。他到达巴比伦之后，便把那个城市包围了。[30]

但是，围攻却拖延了1年又7个月，而不能攻下该城。于是，一个名叫佐披洛斯的波斯人，使用了苦肉计，他割下自己的鼻子和耳朵，剃光了自己的头发，并痛笞了自己，毁了自己的容貌，然后到了起义的巴比伦人那里去，说是被大流士所折磨，因而赢得了巴比伦人的同情，并委任他以军事重任。最后，佐披洛斯按照和大流士的约定，当大流士率大军来攻时，佐披洛斯便打开城门，从而使波斯人攻陷了巴比伦城。起义被镇压，城市的城墙被拆毁，为首的3000人被刺死。[31]大概希罗多德在这里所说的就是这些起义中的一次。

后来，在希腊波斯战争期间，巴比伦尼亚又发生过大规模的起义。那是在大流士的儿子薛西斯上台后的第二年（公元前484年）的塔姆兹月（6—7月），当薛西斯准备远征希腊时爆发的。起义的原因是沉重的赋税负担，以及劳役负担（如把巴比伦人赶去修建王宫），还有就是维持波斯驻防军的负担，维持波斯总督官邸的负担。起义的领导人是一个名叫贝尔·西曼尼的人。起义者不仅夺取了巴比伦城，而且还夺取了波尔西帕和狄尔巴特等城市。但起义维持时间不长，大约只有两个星期。起义的领导人被处死。起义被镇压后，许多神庙财产被没收，巴比伦最大的神庙埃萨吉那受到严重破坏，它的财产被掠夺到帕塞波利斯，马尔都克神像被熔化，传统的新年宗教庆典被禁止，巴比伦王国实际上被取消，和其他被征服的地区一样，变成了一个行省。

公元前482年，巴比伦人再度起义，领导人是沙马什利巴。此时，原来驻守在两河流域的波斯驻防军已经到了小亚，准备远征希腊，两河流域没有剩下什么波斯军队，因而，起义发展很快。起义者夺取了巴比伦、波尔西帕等城市。这个起义对波斯统治者来说是非常危险的，因为，这里是波斯统治的心脏地带，而波斯人又没有多少军队可以利用；它很可能影响到其他地区也起来暴动。波斯国王薛西斯的女婿麦迦比兹被派来镇压起义。起义延续了大约7个月，才被镇压下去。可能有的祭司也参加了起义，所以，部分祭司被处死；一些神庙也遭破坏，神庙中的许多物品被劫掠到了帕塞波利斯（在该地的废墟中发现了巴比伦的阿达德神的印章，上面有“马尔都克神的财产，出自艾沙基尔神庙的阿达德神之印”的铭文）。起义被镇压后，巴比伦城的城墙也被毁坏、铲平，要塞被破坏。大概从这时候起，巴比伦尼亚与亚述地区合并成了一个省（河外地区早已从巴比伦省中分出去）。以后，这里没有再发生过大的起义，直到波斯帝国灭亡。