一、实验目的
(1) 学会用分光光度法测定溶液各组分浓度，并由此求出甲基红离解平衡常数。
(2) 掌握可见光分光光度计的原理和使用方法。
二、实验原理
1． 溶液中各组分含量的测定
分光光度法常用来进行溶液各组分含量的测定。如果溶液中各组分的特征吸收曲线不相重叠，可在波长λ1下测定显著吸收的A物质，而在波长λ2下测定显著吸收的B物质。如果混合物中各组分的吸收曲线相互重叠，只要符合朗伯比尔定律，便可测定其含量。例如，常用作指示剂的甲基红是一元弱酸，它在溶液中存在离解平衡。
Ｎ＋（ＣＨ３）２
ＮＨＮＣＯ２－
酸式（红色）
Ｎ（ＣＨ３）２
ＮＮＣＯ２－＋Ｈ＋
碱式（黄色）
图２６甲基红酸式（ＨＭＲ）和碱式（ＭＲ-)
两组分吸收曲线
上式可简写为：
HMR（酸式）（红色）
MR-（碱式）+H+（黄色）
从上式可知，在酸性溶液中，甲基红指示剂基本上以HMR形式存在；在碱性溶液中，甲基红指示剂基本上以MR-形式存在。可在不同波长下测定HMR和MR-的吸收光谱，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，可得甲基红HMR和MR-两组分的吸收曲线，如图26所示。
从图中可以看出，在波长520nm处，甲基红酸式HMR对光有最大吸收，碱式吸收较小；而在波长430nm处，甲基红碱式MR-对光有最大吸收，酸式HMR吸收较小。同时从曲线上又可看出，在某一定波长下，甲基红溶液的吸光度等于酸式HMR和碱式MR-两者吸光度之和，对于这种含有两组分的体系来说，只要选择两个适当的波长进行两次吸光度的测定，就可以列出二元一次联立方程组，求出该体系内两组分的含量或两组分浓度之比。
例如，波长520nm、430nm时，甲基红溶液的吸光度为：
A总520=AHMR520+AMR-520（1）
A总430=AHMR430+AMR-430（2）
式（1）、（2）表示混合物在波长λ520及λ430测定的吸光度，是两种物质吸光度的简单加和。
根据朗伯比尔定律：
A=K′·c·l
式中：A为吸光度(又称光密度)，即入射光强度与透射光强度之比的对数；l为比色皿的厚度；c为溶液浓度；K′为吸光系数。因此，式（1）、（2）可改写为：
A总520=K′HMR520[HMR]+K′MR-520[MR-]（3）
A总430=K′HMR430[HMR]+K′MR-430[MR-]（4）
式（3）[HMR]得：A总520[HMR]=K′HMR520+K′MR-520[MR-][HMR]（5）
式（4）[HMR]得：A总430[HMR]=K′HMR430+K′MR-430[MR-][HMR]（6）
式（5）式（6）得：A总520A总430=K′HMR-520+K′MR-520[MR-][HMR]K′HMR-430+K′MR-430[MR-][HMR]
整理简化后得：[MR-][HMR]=A总430K′HMR520-A总520K′HMR430A总520K′MR-430-A总430K′MR-520（7）
式中A总520，A总430为一定pH条件下，同时含有酸式HMR和碱式MR-的甲基红溶液在波长520nm、430nm时的吸光度，KHMR520，KHMR430，KMR-520，KMR-430，分别为在波长为520nm和430nm 时，甲基红酸式和碱式的吸光系数。
式（7）中等式右边各项均可由实验得到。于是甲基红溶液碱式MR-和酸式HMR两组分浓度之比可由实验测定。
2． 甲基红酸式指示剂pK值的测定
根据甲基红在水中的电离平衡：
HMR(酸型)MR-（碱型）+H+
平衡常数为：
Ｋ＝[H+][MR-][HMR]
令-lgK=pK，则
pK=pH-lg[MR-][HMR]（8）
其中pH可用pH计测出。将由式（7）求得的[MR-][HMR]之比值代入式（8），甲基红电离常数K值即可计算出来。
三、仪器和试剂
1. 仪器
721 型或722型分光光度计，精密pH计。容量瓶100mL7个，烧杯50mL（烘干）6个，酸式滴定管50mL1个，酸式滴定管25mL2支，碱式滴定管25mL2支，移液管１0mL2支，移液管25mL1支，量筒(50mL)1个，酸式滴定管１0mL（公用）1支。
2． 试剂
甲基红(A.R.)，95％酒精，0.1mol·L-1HAc，0.1mol·L-1HCl，0.01mol·L-1
NaAc，0.04mol·L-1NaAc。
四、实验步骤
1． 甲基红储备溶液的配制
用研钵将甲基红研细，称取1g甲基红固体溶解于500mL95%酒精中，如有少量不溶解可过滤除去。
2． 甲基红标准溶液的配制
由公用滴定管放出5mL甲基红储备液于１00mL容量瓶中，用量筒加入50mL95％酒精溶液，用水稀释至刻度，摇匀。
3． 纯酸式HMR（简称A溶液）和纯碱式MR-（简称B溶液）甲基红溶液的配制
A溶液：取10.00mL甲基红标准溶液，加10.00mL0.1mol·L-1HCl，再加水稀释至100mL，此时溶液的pH大约为2，故此时的甲基红以HMR存在。
B溶液：取10.00mL甲基红标准溶液加25.00mL0.04mol·L-1NaAc，再加水稀释至100mL，此时溶液的pH大约为8，故此时的甲基红以MR-存在。
4． 最高吸收峰的测定
（1） 测定纯酸式HMR(A溶液)的最高吸收峰
取两个1cm比色皿，分别装入蒸馏水和A溶液，以蒸馏水为参比，从420～600nm波长之间每隔20nm测一次吸光度。在500～540nm之间每隔10nm测一次吸光度，以便精确求出最高点之波长。
（2） 测定纯碱式MR-(B溶液)的最高吸收峰
取一个１cm比色皿，装入B溶液，以蒸馏水为参比溶液，测定方法如上，波长范围为410～5４0nm，在410～4６0nm之间每隔10nm测一次吸光度，以便精确求出最高点之波长。
5． 按表22和表23数据分别配制不同浓度的以酸式HMR和碱式MR-为主的甲基红溶液
表２２不同浓度的以酸式为主的甲基红溶液的配制
溶液编号A溶液的体积百分含量A溶液/mL0.1mol·L-1HCl/mL
0#
1#
2#
3#100%
75%
50%
25%20.00
15.00
10.00
5.000.00
5.00
10.00
15.00
表２３不同浓度的以碱式MR-为主的甲基红溶液的配制
溶液编号B溶液的体积百分含量B溶液/mL0.０1mol·L-1NaAc/mL
0#
4#
5#
6#100%
75%
50%
25%20.00
15.00
10.00
5.000.00
5.00
10.00
15.00
6． 配制不同pH下的甲基红溶液
按表２４准确取甲基红标准溶液、0.04mol·L-1NaAc和0.1mol·L-1HAc溶液并加入蒸馏水配制成100mL溶液。不同pH下的甲基红溶液其[MR-]／[HMR]值不同。
表２４配制不同pH下的甲基红溶液
溶液编号标准溶液/mL0.04mol·L-1NaAc/mL0.1mol·L-1HAc/mL
7#
8#
9#
10#10.00
10.00
10.00
10.0025.00
25.00
25.00
25.005.00
10.00
25.00
50.00
五、数据记录
1． 纯酸式甲基红HMR(A溶液)和纯碱式甲基红MR-(B溶液)最高吸收峰的测定
将测得的A溶液和B溶液在不同波长下的吸光度数据分别记录于表２５和表2６。
表２５纯酸式甲基红HMR(A溶液)在不同波长时的吸光度
波长λ/nm420440460480500510
吸光度A
波长λ/nm520530540560580600
吸光度A
表2６纯碱式甲基红MR-(B溶液)在不同波长时的吸光度
波长λ/nm410420430440450460
吸光度A
波长λ/nm480500520５４０
吸光度A
2． 以酸式为主和以碱式为主的甲基红各溶液吸光度的测定
将0#、0′#、1#～6#溶液在波长520nm、430nm下分别测其吸光度，以蒸馏水为参比溶液，将数据记录于表２７和表２８中。
表２7不同浓度的以酸式为主的甲基红溶液在波长520nm、430nm下的吸光度
溶液编号A总５２０A总４３０
0#
1#
2#
3#
表２８不同浓度的以碱式为主的甲基红溶液在波长520nm、430nm下的吸光度
溶液编号A总５２０A总４３０
0′#
4#
5#
6#
3． 不同[MR-]／[HMR]值的甲基红溶液吸光度的测定
将7#～10#溶液在波长520nm、430nm下分别测其吸光度，以蒸馏水为参比溶液，将数据记录于表２９中。
表２９不同[MR-]／[HMR]值的甲基红溶液在波长520nm、430nm下的吸光度
溶液编号A总５２０A总４３０
7#
8#
9#
10#
4． 甲基红溶液pH的测定
用pH计分别测定上述7#～10#溶液的pH，将测得的pH记录于表210中。
表２１０不同[MR-]／[HMR]值的甲基红溶液的pH
溶液编号7#8#9#10#
pH
六、数据处理
（1） 由表２５和表2６中的数据作出Ａ~λ曲线，可分别得到以酸式HMR为主的甲基红溶液(A溶液)和以碱式MR-为主的甲基红溶液(B溶液)的最大吸收波长λ１及λ２。
（2） 求以酸式HMR为主的甲基红溶液和以碱式MR-为主的甲基红溶液的吸光系数：根据朗伯比尔定律，表２７和表２８中溶液的吸光度和其相应溶液浓度(此处为A溶液或B溶液的体积百分含量)的关系是一条直线，直线的斜率即为其吸光系数Ｋ′HMR520，Ｋ′HMR430，Ｋ′MR-520，Ｋ′HMR-430。
(3) 甲基红溶液中[MR-]／[HMR]值的计算：将由表29中测得的甲基红溶液的吸光度和由表27和表28中求得的吸光系数代入式（7），分别计算出7#～10#溶液中[MR-]／[HMR]之值。
（4） 甲基红溶液离解平衡常数K的计算：将测得的pH和相应的[MR-][HMR]比值代入式（8）计算出7#～10#不同浓度甲基红溶液的pK值，取其平均值，K值即为甲基红的离解平衡常数。
七、思考题
（1） 在本实验中，温度对实验有何影响？采取什么措施可以减少这种影响？
（2） 如果溶液没有颜色，能否用这种方法测定？
（3） 7#～10#溶液配制时，各种溶液量取不够准确，对实验有何影响？